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CRISPR-cas9: la rivoluzione dell’editing genomico è premio Nobel della chimica 2020

È la prima volta che nessun uomo entra fra i vincitori di un Nobel: Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, le due scienziate che per prime hanno messo a punto la tecnica rivoluzionaria di editing genomico CRISPR-Cas9, sono state premiate con il Nobel della chimica 2020.

“Son passati quasi due anni da quando avevamo pubblicato un articolo che descriveva come un sistema batterico, chiamato CRISPR-Cas9, potesse essere utilizzato per ingegnerizzare i genomi. Ero rimasta sbalordita dalla rapidità con cui i laboratori di tutto il mondo avevano adottato la tecnologia per applicazioni in tutta la biologia, dalla modifica delle piante all’alterazione dei modelli delle ali di farfalla alla messa a punto dei modelli di ratto delle malattie umane (…), cercano di creare una lattuga resistente ai parassiti, ceppi fungini che hanno ridotta patogenicità e modifiche alle cellule umane che potrebbero un giorno eliminare malattie come distrofia muscolare, fibrosi cistica o anemia falciforme. Sono entusiasta. [1]” Le parole di Jennifer Doudna, oggi docente di Chimica molecolare al dipartimento di Chimica ed Ingegneria Chimica dell’Università della California, lasciano comprendere il veloce successo di CRISPR-Cas9, segno di un valido e potente sistema rivoluzionario dell’editing genomico che ha posto le basi a nuovi trattamenti medici d’avanguardia.

dna

Editing genomico: cos’è? L’editing del genoma è una tecnica di ingegneria genetica che consente agli scienziati di modificare il DNA di molti organismi, comprese piante, batteri e animali. La modifica del DNA può portare a cambiamenti nei tratti fisici, come il colore degli occhi, o persino prevenire l’insorgenza di una malattia genetica. La metodica dell’editing genomico agisce come forbici, “tagliando” il DNA in un punto specifico: a questo punto gli scienziati possono rimuovere, aggiungere o sostituire il DNA dove è stato tagliato [2].

Figura 1. Zebrafish (Danio rerio).

Diversi studi di editing genomico si concentrano sulle malattie umane. Tali studi comprendono l’utilizzo di organismi modello quali ad esempio zebrafish (Fig. 1) o topi (Fig. 2). Tali organismi condividono con gli esseri umani circa l’85% dei loro geni.

Figura 2. Topo da laboratorio. Mus musculus.

L’editing genomico permette di modificare un singolo gene o più geni in un topo osservando come questi cambiamenti influenzano la salute del topo e prevedere come cambiamenti simili nei genomi umani, potrebbero influenzare la salute umana. Infatti, grazie all’ingegneria genetica, gli scienziati sviluppano terapie geniche per prevenire e curare le malattie negli esseri umani [3]. Il potenziale della terapia genica è di enorme portata.

Cosa significa CRISPR? L’acronimo CRISPR sta per Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, cioè brevi sequenze di DNA, ripetute e palindrome (lette al contrario rimangono invariate) ed interspaziate in modo regolare da sequenze di DNA non ripetute. Il termine fu coniato agli inizi del 2000 quando il ricercatore Francisco Mojica ed i suoi colleghi identificarono in diversi DNA procariotici, regioni costituite da brevi sequenze ripetute (repeat) intervallate regolarmente da sequenze non ripetute di DNA (dette spacer). In seguito, lo scienziato Francisco Mojica ed altri gruppi di ricerca indipendenti [4], focalizzarono la loro attenzione sugli spacer e dimostrarono che tali sequenze non erano altro che frammenti di DNA derivati da virus che, in precedenza, avevano cercato di infettare la cellula batterica. Era chiaro quindi che si tratta di una sorta di sistema immunitario che il batterio utilizza per difendersi dagli attacchi virali. Vicino alle sequenze spacer intervallate da sequenze ripetute, il DNA batterico ha anche dei geni che codificano per alcune proteine, le proteine Cas, le quali, una volta identificato il DNA del virus nemico, lo tagliano come delle forbici e incorporano frammenti virali nel DNA batterico (Fig. 3). Questo fa sì che, ad una seconda infezione da parte dello stesso virus, il batterio, possa riconoscere il nemico e tagliare il suo DNA, annullandone così l’attacco. Durante l’infezione, infatti, viene trascritto un CRISPR RNA (pre-crRNA), derivante dallo stampo CRISPR, e codificate le proteine Cas. L’RNA sarà poi frammentato in tanti frammenti corrispondenti ai singoli spacer derivati dai frammenti virali. Ogni pezzetto si lega ad una proteina Cas (Fig. 4). Una volta formata questa “macchina molecolare” il DNA virale verrà scandagliato e se al DNA del virus corrisponde una delle sequenze spaziatrici (spacer) della cellula batterica, essa lo taglia, sopprimendone l’attacco [5][6]. Quindi, tramite il sistema CRISPR-Cas, il batterio riesce a difendersi ad eventuali attacchi virali. Pertanto, si tratta di una sorta di sistema immunitario.

CRISPR-Cas9

Figura 3. Sistema CRISPR-Cas in una cellula procariotica.

CRISPR-Cas9

Figura 4. Infezione virale in una cellula procariotica ed attivazione sistema CRISPR-Cas [7].

Perché quindi il sistema CRISPR-Cas fu così rivoluzionario? Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, nel 2012 pubblicarono su Science l’articolo che rivoluzionò l’editing genomico [8]. Nel loro lavoro, le due scienziate, dimostrano infatti che il sistema CRISPR-Cas9 (Cas9 è una delle proteine appartenente alla famiglia Cas) presente nei batteri, può essere ricreato in laboratorio per modificare e/o eliminare un tratto di interesse in qualsiasi organismo vivente. Come? Per ricreare il sistema CRISPR-Cas9 in un organismo non batterico, occorre quindi: – un RNA-guida, utile in quanto funge da guida per poter ricercare nell’organismo in esame il tratto che si vuole modificare (detto anche sequenza bersaglio) – proteina Cas9, necessaria per il taglio del tratto di interesse. Il funzionamento della tecnica si basa quindi sull’associazione della proteina (Cas9) con L’RNA guida.

L’RNA guida, associato alla proteina Cas9, riconosce la sequenza bersaglio e la proteina introduce un taglio (a monte di una specifica sequenza denominata PAM), rimuovendo così il tratto di interesse (Fig. 5.). Il taglio attiva i processi di riparazione del DNA e, nel caso in cui nella cellula è stata introdotta la sequenza corretta del gene, la ricombinazione omologa provvederà alla sostituzione in modo definitivo.

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Figura 5. Sistema CRISPR-Cas9 in un organismo non batterico.

Applicazioni di CRISPR-Cas9 Il sistema di editing genomico CRISPR-cas9 consente quindi di: – Produrre mutazioni – Correggere i difetti di un gene per permettergli di tornare a funzionare come dovrebbe – Inserire un nuovo segmento di DNA che aggiunga una caratteristica utile. Queste possibilità possono essere applicate a qualunque essere vivente ed aprono sicuramente idee, la cui validazione risulterebbe senza dubbio interessante e rivoluzionaria. La tecnologia CRISPR-Cas9 è utilizzata oggi in diversi campi, come [9][10]: – Agricoltura: ad esempio, si sta cercando di rendere le colture più resistenti al fine di eliminare quasi del tutto i prodotti chimici, come pesticidi, e garantire ugualmente la produzione di frutta e verdura. – Industria: la modifica del DNA delle specie vegetali può trovare applicazioni anche nel settore industriale. Si parla infatti di migliorare la produzione e garantire una migliore performance dei biocarburanti. Lo scienziato Craig Venter con un suo studio su Nature Biotechnology [11] dimostra come si può modificare il DNA dell’alga Nannochloropsis alterandone il metabolismo e fare in modo che produca più lipidi, per poi utilizzarli alla conversione in biodiesel. – Medicina: prevenzione o cura di diverse patologie. Utilizzando il sistema CRISPR-Cas9 sono infatti in corso studi di terapia genica per la cura alla Corea di Huntington, Fibrosi cistica, Distrofia muscolare di Duchenne, Distrofia muscolare dei cingoli, Atrofia muscolare spinale, Atassia di Friedreich, Sclerosi laterale amiotrofica (SLA); studi di immunoterapia contro il cancro; studi per fermare la diffusione di malattie trasmesse da insetti (come la malaria); studi per la cura all’obesità e inoltre l’editing genomico può fornire nuove strategie e applicazioni terapeutiche anche contro le malattie virali infettive (come HIV). Altri studi si concentrano sullo sviluppo embrionale cercando di correggere mutazioni che causano malattie negli embrioni umani, nella speranza di prevenire patologie genetiche.

Insomma, l’editing genomico con il sistema CRISPR-Cas9 ha un potenziale davvero ampio. L’evento che tale sistema, messo a punto da Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, sia stato premiato con il Nobel della chimica 2020, lo conferma.

Fonti [1] Jennifer Doudna (2015), Genome-editing revolution: My whirlwind year with CRISPR, 24/31 DECEMBER 2015 | VOL 528 | NATURE [2] What is genome editing, National Human Genome Research Institute https://www.genome.gov/about-genomics/policy-issues/what-is-Genome-Editing [3] Dana Caroll (2017), Genome Editing: Past, Present, and Future, Yale J Biol Med. 2017 Dec 19;90(4):653-659. eCollection 2017 Dec. [4] Francisco J M Mojica 1, César Díez-Villaseñor, Jesús García-Martínez, Elena Soria (2005), Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements, J Mol Evol. 2005 Feb;60(2):174-82. doi: 10.1007/s00239-004-0046-3. [5] Benedetta Paoletti (2020), È finalmente Nobel per la Chimica alle pioniere di CRISPR-Cas9, https://biomedicalcue.it/ [6] Lara Rossi (2017); CRISPR, la rivoluzione è qui https://aulascienze.scuola.zanichelli.it/ [7] Doudna Lab, CRISPR systems https://doudnalab.org/research_areas/crispr-systems/ [8] Martin Jinek 1, Krzysztof Chylinski, Ines Fonfara, Michael Hauer, Jennifer A Doudna, Emmanuelle Charpentier (2012), A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, Science. 2012 Aug17;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829. Epub 2012 Jun 28. [9] Giulia Dalla giovanna (2019), Dove si può applicare il metodo Crispr/Cas9: dall’agricoltura all’industria, ecco tutte le possibilità, https://www.ohga.it/ [10] Md. Abul Hassan, Nafisa Yesmin (2019), Review on CRISPR/Cas-9 Gene Editing Technology and Its Potential Clinical Application, IOSR Journal Of Pharmacy (e)-ISSN: 2250-3013, (p)-ISSN: 2319-4219 Volume 9, Issue 9 Series. I (September 2019), PP. 01-22 [11] Ajjawi, I., Verruto, J., Aqui, M. et al. (2017) Lipid production in Nannochloropsis gaditana is doubled by decreasing expression of a single transcriptional regulator. Nat Biotechnol 35, 647–652 (2017). doi.org/10.1038/nbt.3865

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